PLGA nanoparticles loaded with warfarin as a novel therapeutic system with modified warfarin biodistribution allowing for limited fetal exposure

Full Text

Актуальность. Варфарин является антикоагулянтом, доказавшим эффективность в профлактике тромбообразования у пациентов с механическими клапанами сердца. Пациенты, которые являются носителями таких клапанов, часто молодые люди, включая женщин репродуктивного возраста. Особенностью тромбопрофилактики у пациентов с механическими клапанами сердца является то, что риск тромбообразования у них чрезвычайно высок, и на сегодняшний день только варфарин имеет доказательства достаточной эффективности, являясь в этой связи безальтернативным препаратом. Беременность в силу гормональных изменений создает дополнительные риски тромбообразования, поэтому и в случае ее наступления пациентки должны получать варфарин по жизненным показаниям [1]. Проблему составляет то, что варфарин является доказанным тератогеном. Повреждающее действие на развитие плода связано с двумя основными механизмами – нарушение процессов карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты белков, отвечающих за синтез остеокальцина, что приводит к нарушению формирования длинных трубчатых костей и костей лицевого скелета, а также собственно антикоагулянтное действие – нарушение карбоксилирования факторов свертывания крови, что приводит к микрокровоизлияниям в плаценте, провоцируя нарушение ее функции, и во внутренних органах плода [2]. Принято считать, что вероятность тератогенеза является фактором степени лекарственного воздействия, по этой причине существуют рекомендации, согласно которым доза варфарина для беременных не должна превышать 5 мг [3]. Однако в силу индивидуальных различий в концентрациях варфарина, создаваемых одними и теми же дозами у разных людей, такое ограничение не может защитить плод от повреждающего действия препарата, или может вызвать недостаточную степень терапевтической антикоагуляции и подвергнуть женщину риску жизнеугрожающих тромботических осложнений. Варфарин является малой молекулой, хорошо проникающей через плаценту.  

В последние годы большой интерес привлекают возможности модификации фармакокинетики и трансплацентарного переноса с помощью наночастиц, нагруженных тем или иным лекарственным препаратом[4]. Наночастицы, исследованные при беременности, могут быть представлены ионизируемыми липидными формами, органическими полимерами, а также неорганическими структурами на основе кремния, золота, серебра и других. В ряде исследований показаны изменения проницаемости плацентарного барьера для лекарственных средств в случае их погружения в наноматериал [5], что может позволить снизить вероятность воздействия лекарственных препаратов на плод. Некоторые наноматериалы уже доказали свою безопасность для человека и одобрены для использования. К таким наноматериалам относятся липосомальные формы, которые уже применяются в том числе у беременных [6], а также полимерные материалы, в частности полимер на основе молочной и гликолевой кислот (полилактид-ко-гликолид, PLGA). Среди известных полимеров PLGA имеет преимущество, поскольку допущен FDA (Food and Drug Administration) для клинического применения у человека в целях диагностики, доставки лекарств, в том числе таргетной терапии злокачественных новообразований и другое [7]. Доказана полная биосовместимость материала, нетоксичность, неиммуногенность и биодеградируемость [8]. В исследованиях in vitro показано отсутствие токсичности и негативного влияния на эмбриональное развитие мышей и последующее развитие плодов in vivo [9].  

Целью нашего исследования явилось создание, изучение кинетики высвобождения и биораспределения новой лекарственной системы в составе варфарина, погруженного в полимерный наноноситель (PLGA) для предположительно возможного ограничения его трансплацентарного переноса у беременных при сохранении терапевтической активности. 

Материал и методы исследования. В работе использованы следующие реактивы. Сополимер молочной и гликолевой кислот, PLGA, medical grade (Новохим, г. Томск, РФ) с соотношением лактид/гликолид, 48-52 / 48-52 %, молекулярной массой 1 000 – 80 000 Да, коэффициентом полидисперсности < 2 и остаточным содержанием мономеров < 0.5 %, варфарин, analytical standart (Sigma Aldrich, USA), ацетон, ЧДА (ЗАО Вектон, СПб, РФ). Индоцианин зеленый P.А. (CARL ROTH, Germany). Использовался полностью гидролизованный поливиниловый спирт молекулярной массой 35 – 50 кДа, чистотой 98 – 99% (Ленреактив, РФ). 

Экспериментальные животные – мыши стока CD-1 весом 25 г± 10 %. получены из питомника лабораторных грызунов ветеринарной службы комплекса центра доклинических и трансляционных исследований ФГБУ «НМИЦ им. В.А.Алмазова» Минздрава России), материнское поголовье получено из питомника лабораторных животных ИЦИГ СО РАН. 

Методика синтеза наночастиц. Полимерные наночастицы PLGA были синтезированы методом нанопреципитации, основанном на смешивании органической и водной фаз при интенсивном перемешивании. Органическая фаза состояла из 50 мл раствора PLGA в ацетоне в концентрации 1%. Водную фазу получали растворением 500 мг поливинилового спирта (ПВС) в воде в концентрации 1% при температуре 90°С с помощью магнитной мешалки (IKA C-MAG HS 7). В водную фазу добавляли индоцианин зеленый (ИЦЗ) ввиду его хорошей растворимости в воде при температуре 20°C (растворимость 1 г/л), а в органическую фазу - варфарин ввиду его хорошей растворимости в ацетоне (по данным Hazardous Substances DataBank – 65 г/л). Раствор ПВС объемом 50 мл помещали в магнитную мешалку при температуре 55°С и скорости перемешивания 300 об/мин. В него капельно с помощью пипетки Пастера вносили 10 мл приготовленного раствора PLGA. Перемешивание и нагревание продолжали до исчезновения запаха органического растворителя. Оптимальная концентрация варфарина была подобрана экспериментальным путем, а именно: уменьшали количество варфарина до тех пор, пока он не перестал выпадать в осадок. Итоговая концентрация составила 0,1 мг/мл. 

Конечная система имела следующий состав: 1% PLGA в ацетоне 10 мл с добавлением 5 мг варфарина, и водная фаза – 50 мл с ПВС в концентрации 0,3% с добавлением 5 мг ИЦЗ. В экспериментах использовали свежеприготовленный раствор.  

Исследование стабильности системы. Распределение по размерам и дзета-потенциал полученных частиц изучали в водной среде при помощи метода динамического рассеяния света (Dynamic Light Scattering - DLS) и метода электрофоретического рассеяния света (ELS - Electrophoretic Light Scattering) соответственно с помощью прибора Zetasizer Ultra (Malvern Instruments, UK). Использовали следующие параметры прибора. DLS: время накопления кореляционной функции составляло 120 с, распределение по размерам измеряли в трёх сериях, температура образца составляла 25 ̊С, использовали метод анализа General Purpose, ELS: температура 25 ̊С, Analisys model – Auto Mode. За средний гидродинамический размер принимали значение Z-average, которое рассчитывалось по первичным данным Size Distribution Intensity. 

Изменение концентрации ПВС позволило синтезировать частицы размерами от 150 нм до 350 нм. Поскольку значение дзета потенциала критически изменялось при увеличении концентрации ПВС выше 0,3%, что говорит о резком уменьшении стабильности системы, оптимальным размером в конечном итоге является размер 0,1 или 0,3% ПВС, и результирующий размер наночастиц около 150 нм.  

Изучение кинетики высвобождения. После синтеза наночастицы помещали раствор в диализный мешок с размером пор 3,5 кДа. В целях изучения кинетики спонтанного высвобождения варфарина из синтезированного раствора проводили серию отборов проб в процессе диализа. После отмывки образец (50 мл) в диализном мешке помещали в 500 мл буфера PBS. Аликвоты отбирали при перемешивании на магнитной мешалке в определенное время и объем доводили раствором буфера. Пробы отбирали в следующие промежутки времени: 0, 15, 30, 45,60, 75, 90 минут, дале 46, 47, 48, 70, 120, 164, 215, 288 ч.   

Протокол исследования. В исследование включили 6 мышей. Мыши содержались в обычных условиях с неограниченным доступом к воде в соответствии с ветеринарными требованиями. После ссаживания беременность определяли по формированию вагинальной пробки. Этот день считали первым днем беременности. Беременные мыши были отсажены в отдельную клетку для участия в эксперименте. В целях изучения биораспределения синтезированной системы выбрали 2 этапа на протяжении беременности. Сроки гестации были выбраны для соответствия периодам гестации у человека. Первому триместру соответствовал срок гестации 10 дней, далее оценивали период 14 дней, соответствующий становлению фето-материнского полноценного кровотока и приблизительно 2-3 триместру беременности у человека[10]. Для введения использовали синтезированную систему PLGA-ИЦЗ-варфарин с концентрацией варфарина 0,1 мг/мл. 100 мкл варфарина с PLGA и ИЦЗ вводили беременным мышам в хвостовую вену на 10 и 14 дни гестации – по 2 мыши на каждый срок, 2 контрольных животных). Животных подвергали гуманной эвтаназии передозировкой наркоза (изофлюран) через 60 минут после введения исходя из предположения, что к этому моменту препарат в составе наночастиц уже распределится в организме, но свободные варфарин и ИЦЗ еще не высвободятся в значительной степени, что позволит получить представление о распределении синтезированного продукта. Выделяли органы и определяли их флуоресценцию методом флуоресцентной визуализации на флуоресцентном томографе IVIS Spectrum Lumina (PerkinElmer, USA) с фильтрами, установленными на определение ИЦЗ (длинна волны поглощения 745 нм, эмиссии 820 нм). Обработка полученных флуоресцентных изображений произведена на встроенном ПО Living Image 4.7.4. Сигналы флуоресценции считывались с цветовых карт изображений с помощью выделения контура ROI (исследуемая область интереса). 

Часть материала гомогенизировали и замораживали для хроматографического определения варфарина (ВЭЖХ-МС).  

Исследования на лабораторных животных проводились с разрешения локального этического комитета Национального медицинского исследовательского центра имени В. А. Алмазова (протокол 21-05ПЗ#V2 от 23.03.2021). 

Методика хроматографического определения Варфарина. Определение варфарина осуществляли методом ВЭЖХ-МС с использованием жидкостного хроматографа Bruker Elute UHPLC с масс-спектрометрическим детектором Bruker Q-TOF Maxis Impact с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении на аналитической колонке Intensity Solo 1.8 C18-2 100 × 2.1 mm. Для приготовления исходного раствора варфарина с концентрацией 1 мг/мл навеску сухого вещества массой 1 мг растворяли в 1 мл смеси ацетонитрил : вода : муравьиная кислота (70 : 30 : 0,1). Для приготовления раствора варфарина с концентрацией 10 мкг/мл в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) объемом 10 мл было внесено 100 мкл исходного раствора варфарина с концентрацией 1 мг/мл. Аликвоту раствора варфарина в ФСБ объемом 1,0 мл переносили в пробирки типа «эппендорф» объемом 2,0 мл, прибавляли 10 мкл муравьиной кислоты и проводили двукратную жидкость-жидкостную экстракцию метил-трет-бутиловым эфиром, концентрировали досуха под током азота, а затем реконструировали в 1 мл смеси ацетонитрил : вода : муравьиная кислота (70 : 30 : 0,1). 

К образцу плазмы крови объемом 1 мл, заведомо не содержащей варфарин, добавляли аликвоту исходного раствора аналита для достижения концентрации 1,0 мкг/мл. Полученный образец тщательно перемешивали и аликвотировали по 50 мкл в пробирки типа «эппендорф» объемом 1,5 мл. Для последующего ВЭЖХ-МС анализа к аликвоте плазмы крови добавляли 150 мкл ацетонитрила для депротеинизации, тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали верхний слой. 

В качестве подвижной фазы использовали 0,1 об. % муравьиной кислоты в воде (А) и 0,1 об. % муравьиной кислоты в ацетонитриле (Б) , в следующих условиях градиентного элюирования: 0,0 – 2,0 мин – 70-90 % Б, 2,0 – 3,0 мин – 90 % Б, 3,0 – 3,2 мин – 90-70 % Б, 3,2 – 5,0 мин 70 % Б. Температура колонки – 40°C; Температура автосэмплера – 4°C; Объем вводимой пробы – 2 мкл. Поток газа-осушителя 8 л/мин; давление на небулайзере 29,0 psi; напряжение на капилляре 4500 В; температура проводящего капилляра 220°C; диапазон m/z 50 – 1300 а.е.м.; режим регистрации ионов – положительный. Аналитические характеристики варфарина: C19H16O4 [M+H]+, RT = 1,7 мин, m/z 309,1121 ± 0,005. 

Была проведена оценка СКО, CV, правильности, определены нижний порог определения (НПО) (1 нг/мл), нижний порог количественного определения (НПКО) (10 нг/мл), верхний порог количественного определения (ВПКО) (25 мкг/мл). 

Методы статистической обработки данных. Для описания признаков с отличным от нормального распределения находили медиану и 25-й, и 75-й процентили [Ме (25; 75 %)]. Для оценки достоверности различий между двумя несопряжёнными совокупностями применяли U-критерий Манна — Уитни, а между несколькими несопряжёнными совокупностями - критерий Краскела-Уоллиса. Статистическая обработка данных будет осуществляли с помощью пакета прикладных программ GrapPad Prism 8.0.1 

Полученные результаты и их обсуждение. Характеристики синтезированной системы. Исследование при помощи просвечивающего электронного микроскопа показало, что синтезированная система представляет собой сферические частицы, размером в поперечном сечении порядка 100-200 нм (большинство молекул, включая варфарин, имеют размер не более 1 нм, иммуноглобулинов, для которых плацента проницаема в 3м триместре – до 15 нм).  

Размер наночастиц изменять путем изменения концентрации PLGA в ацетоне не представлялось возможным, он сохранялся на едином уровне. Изменение концентрации ПВС позволило синтезировать частицы размерами от 150 нм до 350 нм. Поскольку значение дзета потенциала критически изменялось при увеличении концентрации ПВС выше 0,3%, что говорит о резком уменьшении стабильности системы, оптимальным размером в конечном итоге является размер 0,3% ПВС, и результирующий размер наночастиц около 150 нм. Подробные сведения о синтезе и характеристиках системы опубликованы отдельно [11]. 

Результаты изучения уровня захвата варфарина системой и кинетики высвобождения отражены в таблице 1.  

Таблица 1. Концентрации варфарина в диализате (кинетика высвобождения) 

Время, ч	PLGA-варфарин		PLGA-варфарин-ИЦЗ
	Варфарин, мкг/мл	% max (10 мкг/мл)	Варфарин, мкг/мл	% max (25 мкг/мл)
0,00	3,74
0,25	0,27	2,73	0,33	1,33
0,50	0,43	4,32	0,64	2,55
0,75	0,54	5,36	1,06	4,22
1,00	0,72	7,15	1,35	5,41
1,25	0,74	7,40	1,58	6,31
1,50	0,97	9,68	1,81	7,23
46,00	3,63	36,34	8,25	32,99
47,00	3,72	37,18	9,07	36,28
48,00	3,75	37,45	8,65	34,59
70,00	4,97	49,65	12,94	51,75
120,00	4,85	48,47	14,11	56,44
164,00	4,82	48,24	10,80	43,20
216,00	4,23	42,25	11,90	47,59
288,00	4,01	40,13	13,64	54,56

 

Полученные данные свидетельствуют о том, что степень захвата варфарина наночастицами составила 63%. Согласно результатам отбора последующих проб в эксперименте оценки кинетики высвобождения выяснено, что через 90 минут из наночастиц выделяется около 10% варфарина. Все исходное количество варфарина находилось в растворе через 70 ч, что говорит о полном высвобождении. Затем концентрации значимо не изменялись, что может свидетельствовать об отсутствии дальнейшего высвобождения варфарина (Рисунок 1). 

 

Рис. 1. Кинетика высвобождения варфарина из состава наночастиц PLGA без включения ИЦЗ и с включением ИЦЗ в систему.  

 

Результаты биораспределения. При регистрации сигнала от ИЦЗ отмечено, что распределение было более интенсивным на сроке 14 дней гестации. Наибольшая интенсивность сигнала на всех сроках регистрировалась в печени, на 14 день – в печени и почках. Флуоресцентного сигнала от плодов получено ни на одном сроке не было (Рисунок 2).  

 

Рисунок 2. Интенсивность флуоресцентного сигнала после внутривенного введения исследуемого вещества беременным мышам на сроке 10 дней (верхний ряд) и 14 дней (нижний ряд) гестации. 

В целях верификации полученных результатов провели количественное определение варфарина. Максимальными концентрации были в печени, аналогично данным, полученным по результатам анализа флуоресценции ИЦЗ. В целом концентрации коррелировали с интенсивностью свечения во всех органах, кроме почек и плодного компартмента (данные не показаны), что может быть связано с индивидуальными особенностями кинетики ИЦЗ в организме. Концентрации в плодном компартменте были сопоставимыми с другими тканями. Наименьшие концентрации определялись в ткани головного мозга (Рисунок 3). Через 60 минут после внутривенного введения PLGA, нагруженных варфарином с ИЦЗ во всех органах содержание варфарина относительно плазмы составляло менее 1%, а в плодном компартменте менее 0,1%. Была выявлена тенденция к более значимому распределению в ткани на более позднем сроке гестации (Рисунок 4).  

 

Рис. 3. Средние значения концентраций варфарина в биологических образцах мышей на 2х сроках гестации после введения его в составе системы PLGA-варфарин-ИЦЗ. 

 

 

Рисунок 4. Распределение варфарина в органах мышей относительно плазмы крови на 2х сроках гестации после введения его в составе системы PLGA-варфарин-ИЦЗ. 

 

В ходе проведенных экспериментов была синтезирована система, в которой варфарин эффективно погружался в полимерные наночастицы (PLGA) с коэффициентом захвата 63%, что в целом можно назвать хорошим показателем относительно других вариантов захвата лекарственных средств PLGA методом нанопреципитации. Очевидно, этому способствует хорошая растворимость варфарина с органическом растворителе[12]. Подтверждение эффективности удержания варфарина в растворителе мы видим в исследованиях кинетики высвобождения, исходя из которых можно сделать вывод, что варфарин будет менее доступен для органов и тканей на протяжении 3х суток после внутривенного введения в составе PLGA. Учитывая длительный период полувыведения варфарина, составляющий около 37 ч для левовращающего стереоизомера, и до 89 ч для правовращающего, это создает предпосылки для существенно продленной циркуляции варфарина в организме при его относительно более низких концентрациях в тканях[13].  

Распределение варфарина преимущественно в печень, что является характерным путем захвата полимерных органических наночастиц, которое мы наблюдали в наших экспериментах, может обеспечить выгодное перераспределение варфарина с его принципиальной доставкой в орган, где реализуется его фармакологическое действие – влияние на синтез факторов свертывания, при минимизации его трансплацентарного переноса [14].  

Данные о возможности трансплацентарного переноса варфарина в двух наших исследованиях различались. Так, ИЦЗ не обнаруживался в плодном компартменте, но сам варфарин определялся в концентрациях, сопоставимых с другими тканями. Эти данные можно объяснить тем, что ИЦЗ характеризуется плохой проницаемостью для плацентарного барьера и в случае изучения трансплацентарного переноса является поэтому неполноценным его маркером, однако его применение позволило одновременно адекватно описать распределение системы в другие органы и ткани [15].  

Носитель PLGA был изучен в качестве системы для применения во время беременности. Опубликованы данные, свидетельствующие о том, что PLGA способен проникать через плацентарный барьер. Группа американских исследователей при изучении распределения пэгилировнных форм PLGA при вагинальном введении показала, что PLGA через 24 часа после введения детектируется в тканях репродуктивной системы и плодах беременных мышей[16]. С разными лекарственными препаратами были получены разные данные. Наночастицы с ядром из PLGA и оболочкой на основе мембран эритроцитов характеризовались наибольшим накоплением частиц в печени и селезенке, а также определялись в плодном компартменте, увеличиваясь по мере прогрессирования беременности [17]. Такие же тенденции мы наблюдали в своем исследовании. При этом авторы исследования отметили зависимость плацентарного переноса от размера частиц. Частицы размером более 180 нм не проникали через плаценту. В нашем исследовании проникновение системы в плодный компартмент, как и в другие ткани, было очень низким – менее 0,5% при размере частиц около 150 нм. Дизайн эксперимента в виде лишь одной точки забора биологического материала и отсутствия системы сравнения не позволяет установить степень изменения трансплацентарного переноса, и с этой точки зрения исследование носит пилотный характер. Однако наблюдаемое преимущественное распределение в печень создает предпосылки для возможного сохранения терапевтического эффекта путем таргетирования транспорта лекарства в этот орган при одновременном ограничении его распределения во внепеченочные ткани. В ряде исследований наблюдали усиление переноса лекарств при сорбировании с PLGA. В частности, группа американских исследователей продемонстрировала усиление транспорта дексаметазона, погруженного в PLGA в модели клеток трофобласта человека (BeWo b30). При этом эффективность переноса была обратно пропорциональна размеру наночастиц[18]. Подобные результаты были получены для дигоксина, соединенного с пегилированными PLGA наночастицами – транспорт через клеточную линию BeWo b30 был существенно увеличен [19]. В другом исследовании с применением клоназепама, который погружали в сополимер из полиэтиленгликоля и полилактида, смогли добиться замедления транспорта клоназепама через слой клеток BeWo b30 [20]. 

Основным ограничением нашего исследования является его недостаточность данных для того, чтобы полноценно охарактеризовать кинетику вновь синтезированной системы. Для ответа на этот вопрос запланировано отдельное исследование. В то же время полученные данные позволили получить представление об относительном распределении варфарина в составе PLGA в организме беременных мышей. 

Выводы. Синтезированная система из PLGA, нагруженного варфарином, характеризуется стабильностью и удовлетворительными характеристиками в растворе. Кинетика высвобождения свидетельствует о достаточной степени удержания наноносителем варфарина, что позволяет модифицировать его распределение в организме. Предварительные данные о биораспределении синтезированной системы свидетельствуют о том, что она способна проникать через плацентарный барьер, однако одновременно с этим создает существенно более высокие концентрации в печени, что может позволить модифицировать распределение и достичь максимального высвобождения вещества в органе, где осуществляется его фармакологический эффект с одновременным ограничением распределения в других органах и тканях. Это может позволить с равной эффективностью использовать систему в более низких дозах, уменьшая степень воздействия варфарина на плод даже в отсутствие ограничения его трансплацентарного переноса

About the authors

Xenia Alexandrovna Zagorodnikova

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: Ksenia.zagorodnikova@gmail.com

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor at the Institute of Medical Education, Head of Department of Clinical Pharmacology

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

Ophelia Andreyevna Boetticher

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: bettikher_oa@almazovcentre.ru

PhD, Assistant of the Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

Dmitry Vladimirovich Korolev

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: korolev_dv@almazovcentre.ru

Candidate of Technical Sciences, Associate Professor, Head of the Research Institute of Nanotechnology

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

Galina Anatolievna Schulmeister

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: shulmeyster_ga@almazovcentre.ru

M.N.S. NIL nanotechnology

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

Marina Vasyutina

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: vasyutina_ml@almazovcentre.ru

Chief Veterinarian of the Veterinary service of the Testing center of the Preclinical and Clinical Research Center complex

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

Elizaveta Dmitrievna Kessenich

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: kessenikh_ed@almazovcentre.ru

Researcher at the Institute of Metabolic and Metabolic Profiling of the National Research Center for Unknown, Rare and Genetically Determined Diseases

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

Irina Evgenievna Zazerskaya

Almazov National Research Medical Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: zazerskaya_ie@almazovcentre.ru

MD, Professor, Head of the Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russia

References