ANALYSIS OF MAST CELLS REPRESENTATION IN THE LUNGS OF COVID-19 PATIENTS WITH RESPIRATORY SUPPORT AND ACID-BASE STATUS DISORDERS.


Cite item

Full Text

Abstract

New coronavirus infection COVID-19 is characterized by the development of diffuse alveolar damage, often accompanied by the development of respiratory failure and acid-base imbalance. Mast cells (MCs) are of interest due to their involvement in the mechanisms of COVID-19 lung damage. The aim of the study was to determine the features of the representation and degranulation activity of chymase- and tryptase- positive MCs in the lungs of COVID-19 patients, including respiratory support and in conditions of acid-base imbalance. Materials and methods. The study included 55 patients died because of COVID-19 and 30 controls. The need for respiratory support was analyzed, and acid-base status was determined. Microslides of autopsy lung material were made with immunohistochemical staining to detect tryptase and chymase. A comparative analysis of MCs representation between groups and a correlation analysis with clinical and laboratory parameters were performed. Results. Significantly higher total content of tryptase-positive MCs (p=0.033) and a lower content of single degranulating tryptase-positive MCs, fragments and chymase-positive MCs (p < 0.001, p < 0.001 and p=0.013, respectively) were detected in the lungs of patients with COVID-19. The duration of non-invasive mechanical ventilation (NIV) correlated with the content of single tryptase-positive MCs and fragments (p=0.005, r=-0.371 and p=0.046, r=0.270). In a group of patients (n=12), the acid-base balance indicators were determined, and a tendency towards the development of respiratory acidosis was noted. As pH decreased, the content of single tryptase-positive MCs decreased (r=0.565, p=0.015) and the proportion of fragments (r=-0.605, p=0.008) increased. The PaCO2 level correlated with the content of single non-degranulating (r=-0.573; p=0.041), and lactate with the content of co-adjacent degranulating chymase-positive MCs (r=0.736; p=0.006). Conclusion. In patients with COVID-19, the content of tryptase-positive MCs is increased, but their degranulation activity is reduced. Representation of chymase-positive MCs is reduced in COVID-19 patients. A decrease in the content of single non-degranulating tryptase-positive MCs and an increase in the proportion of their fragments were established with increasing duration of NIV and the emergence of the need for invasive ventilation, reflecting the dynamics of the degranulation process. Increased degranulation of tryptase- and chymase-positive MCs was detected during the development of respiratory acidosis.

Full Text

Актуальность. Поражение легких у пациентов с новой коронавирусной инфекцией (НКИ) Coronavirus disease 2019 (COVID-19) характеризуется развитием диффузного альвеолярного поражения и часто сопровождается явлением острой дыхательной недостаточности и развитием респираторного ацидоза, что вызывает необходимость проведения респираторной поддержки и коррекции показателей кислотно-основного состояния. Особый интерес представляют гистологические особенности легочной ткани у данных пациентов, в том числе представительство тучных клеток (ТК), иммунных клеток миелоидного ряда, взгляд на которые был снова обращен наукой с позиции их участия в патогенезе повреждения легких при COVID-19.

Как известно, ТК дегранулируют с высвобождением биологически активных веществ, в том числе специфических протеаз: химазы и триптазы. Химаза участвует в ремоделировании внеклеточного матрикса путем активации металлопротеиназ, играет роль в привлечении моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов, образовании ангиотензина II из ангиотензина I, что объясняет ее значение в развитии легочной гипертензии, участвует в стимулировании ангиогенеза, активации интерлейкинов-1β,-8,-18, трансформирующего фактора роста-β и тд. [1, 2]. Имеются данные о протективных свойствах химазы ТК за счет ограничения гиперактивации нейтрофилов в условиях тканевой ишемии [3]. Триптаза оказывает влияние на внеклеточный матрикс, участвует в ангиогенезе, разрушении фибриногена, высвобождении факторов роста, потенцирует высвобождение гистамина [4]. Описанные эффекты могут иметь значение в патогенезе COVID-19, обеспечивая воспаление, эндотелиальную дисфункцию и развитие фиброза в легких.

Имеются исследования представительства ТК в легочной ткани и бронхоальвеолярной жидкости пациентов с COVID-19, а также уровня протеаз в крови пациентов [5, 6, 7, 8, 9]. Вместе с тем, до настоящего время не установлены связи представительства химаза- и триптаза-позитивных ТК с клинико-лабораторными показателями.

Целью работы было определить особенности представительства и дегрануляционной активности химаза- и триптаза-позитивных ТК в легких пациентов с COVID-19, в том числе на фоне респираторной поддержки и в условиях нарушения кислотно-основного равновесия.

Материал и методы исследования. Проанализированы данные 407 пациентов с COVID-19, проходивших лечение в БУЗ ВО «ВГКБСМП №1» и БУЗ ВО ВОКБ№1. В исследование включались пациенты возрастом от 18 до 75 лет с диагнозом: НКИ COVID-19, подтвержденная методом полимеразной цепной реакции, внебольничная двусторонняя полисегментарная пневмония, острый респираторный дистресс-синдром. Были исключены больные с наличием хронических заболеваний дыхательной системы, тромбоэмболии легочной артерии, других (кроме COVID-19) инфекционных заболеваний легких, хронической сердечной недостаточности выше IIА стадии по классификации Н.Д. Стражеско и В.Х. Василенко, гидроторакса, хронической болезни почек выше С2 стадии, сахарного диабета, злокачественных новообразований, гепатита, цирроза печени и курения в анамнезе. С учетом этих критериев 212 пациентов были исключены из исследования.

В основную группу были отобраны 55 пациентов (29 (53%) мужского и 26 (47%)  женского пола), умерших в результате крайне тяжелого течения COVID-19. Возраст составил 67 [62;71] лет. Проанализирована потребность пациентов в проведении кислородотерапии, неинвазивной (НИВЛ) и инвазивной искусственной вентиляции легких (иИВЛ). Определены показатели кислотно-основного состояния (КОС): pH крови, парциальное давление углекислого газа крови (PaCO2), парциальное давление кислорода крови (PaO2), бикарбонат (HCO3-), избыток оснований (BEb), лактат. Учитывались показатели в динамике: при поступлении и в последнем прижизненном анализе.

Контрольную группу составили 30 человек: 16 (53%) мужчин и 14 (47%) женщин, без COVID-19, умерших от внешних причин. Средний возраст составил 64,5 [58;70] лет. Не установлено достоверных отличий между группами по половозрастным показателям и набору сопутствующих заболеваний

Посмертно у лиц обеих групп производился забор участка легочной паренхимы с фиксацией в 10% нейтральном забуференном формалине. Для проведения иммуногистохимического анализа производились срезы толщиной 2 мкм, использовались первичные мышиные антитела Anti-Mast Cell Tryptase antibody (клон AA1, #ab2378, разведение 1:4000) и Anti-Mast Cell Chymase antibody (#ab233103, разведение 1:1000). После подготовки микропрепаратов на базе НИИ Экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО «ВГМУ им. Н.Н. Бурденко» был проведен анализ с использованием микроскопа ZEISS Axio Imager.А2 (Carl Zeiss, Germany). Анализ микропрепаратов включал просмотр на объективе ×40 не менее 50 полей зрения и подсчет общего числа химаза- и триптаза-позитивных ТК, отдельно дегранулирующих и недегранулирующих, одиночных и совместно прилежащих ТК, а также их фрагментов.

Для выполнения статистического анализа полученных данных использовалось программное обеспечение Statgraphics Centurion XV.I, version 15.1.2 (Statgraphics Technologies, Inc., США). Нормальность распределения оценивалась с использованием критерия Шапиро-Уилка и нормализованных коэффициентов эксцесса и асимметрии. Данные представлены в виде Me [V0,25; V0,75], где Me – медиана, V0,25 и V0,75 – верхний и нижний квартили. Для сравнения групп использовали критерий Манна-Уитни. Для корреляционного анализа применяли коэффициент корреляции Спирмена. При условии p<0,05 связи оценивались как статистически значимые.

Исследование одобрено этическим комитетом ВГМУ имени Н.Н. Бурденко Минздрава России (протокол №8, 17 ноября 2021г.).

Полученные результаты и их обсуждение. Проведен сравнительный анализ представительства химаза- и триптаза-позитивных ТК в легочной ткани больных COVID-19 и в контрольной группе. В основной группе по сравнению с контролем выявлено статистически значимо большее общее количество триптаза-позитивных ТК на мм2 легочной ткани (30,1 [18, 2; 41, 6] и 22,1 [15, 2; 27, 9], p=0,033), а также содержание одиночных (26,0 [16, 1; 38, 3] и 16,78 [12, 82; 22, 5], p=0,005) и одиночных недегранулирующих (10,4 [7, 13; 18, 9] и 1,78 [1, 17; 2, 22], p<0,001), а также совместно прилежащих недегранулирующих (0,53 [0, 07; 0, 8] и 0 [0; 0, 44], p<0,001). Вместе с тем, в основной группе ниже, чем в контроле, относительное содержание одиночных дегранулирующих ТК (43,02 [39, 51; 51, 11] и 72,13 [65, 21; 77, 21], p<0,001), совместно прилежащих дегранулирующих ТК (2,13 [1, 02; 3, 45] и 3,77 [2, 74; 5, 23], p<0,001), а также абсолютное содержание фрагментов (1,33 [0, 67; 2, 13] и 2,56 [1, 39; 5, 72], p<0,001).

Motta Junior J.D.S. и соавт. ранее обнаружили увеличение содержания ТК в легких умерших больных COVID-19, а Zhou Z. и соавт. в бронхоальвеолярной лаважной жидкости пациентов с COVID-19 [6, 8]. Другие авторы обнаружили увеличенные уровни химазы и β-триптазы крови пациентов с COVID-19, свидетельствующие о системной активации ТК [7]. Независимо от них, Tan J. и соавт. тоже определили повышенный уровень химазы сыворотки крови у больных COVID-19 [5]. Однако в исследуемой нами когорте пациентов с COVID-19 по сравнению с контролем обнаружено меньшее общее содержание химаза-положительных ТК на мм2 легочной ткани (1,07 [0, 54; 2] и 1,87 [0, 8; 4, 57], p=0,013), сниженное количество одиночных химаза-позитивных ТК (1,07 [0, 36; 1, 82] и 1,8 [0, 7; 3, 43], p=0,034), в том числе дегранулирующих (0,73 [0, 36; 1, 45] и 1,2 [0, 47; 2, 76], p=0,048) и недегранулирующих (0 [0; 0, 36] и 0,44 [0, 13; 0, 89], p<0,001), а также совместно прилежащих ТК (0 [0; 0] и 0 [0; 0, 08], p=0,011) и фрагментов ТК (0 [0; 0] и 0,13 [0; 0, 67], p<0,001).

Среди пациентов основной группы проанализирована потребность в проведении респираторной поддержки (рис.1).

 

Рис. 1. Распределение пациентов основной группы в зависимости
от потребности в респираторной поддержке

 

Корреляционный анализ продолжительности НИВЛ с представительством триптаза-положительных ТК в легких пациентов выявил следующие статистически значимые связи (рис.2).

Потребность в проведении иИВЛ отрицательно коррелировала с содержанием одиночных дегранулирующих (%) и с общим количеством одиночных триптаза-позитивных ТК (%) (r=-0,324; p=0,016 и r=-0,360; p=0,007, соответственно). Напротив, положительные связи были установлены с содержанием совместно прилежащих триптаза-положительных ТК без признаков дегрануляции (%) (r=0,304; p=0,024) и фрагментов триптаза-позитивных ТК (r=0,327; p=0,015).

 

Рис.2. Корреляционный анализ представительства триптаза-позитивных ТК в легочной ткани и продолжительности НИВЛ у пациентов с COVID-19

Условные обозначения: один. тп-ТК – одиночные триптаза-позитивные тучные клетки; тп-ТК – триптаза-позитивные тучные клетки; НИВЛ – неинвазивная искусственная вентиляция легких. A: p=0,005, r=-0,371; Б: p=0,046, r=0,270. Указаны коэффициенты корреляции Спирмена.

 

У части пациентов (n=12) двукратно в динамике были определены показатели КОС. PH крови в анализе, выполненном при поступлении в стационар и последнем прижизненном анализе составил 7,32 [7, 29; 7, 34] и 7,28 [7, 14; 7, 34], соответственно, PaCO2 43,5 [38; 51] и 73 [51; 80]  мм рт.ст. (прирост на 68%), соответственно, HCO3- 22,5 [20; 24] и 22 [20; 24] ммоль/л, PaO2 35 [21; 43] и 41 [25; 44] мм рт.ст., BEb 1,4 [1, 3; 3, 2] и 2,6 [1, 4; 4, 7] ммоль/л, лактат 2,35 [1, 78; 3, 05]  и 2,4 [1, 4; 3, 5] ммоль/л, соответственно. Таким образом, отмечается тенденция к развитию респираторного ацидоза, традиционно сопровождающего явление дыхательной недостаточности

По мере снижения pH отмечено уменьшение содержания одиночных триптаза-положительных ТК и увеличение доли фрагментов (рис.3).

Рис. 3. Корреляционные связи pH крови и показателей триптаза-позитивных тучных клеток в аутопсийном материале легких пациентов с COVID-19
условные обозначения: один.тп-ТК – одиночные триптаза-позитивные тучные клетки; тп-ТК –триптаза-позитивные тучные клетки. А: r=0,565; p=0,015; Б: r=-0,605; p=0,008. указаны коэффициенты корреляции Спирмена.

Уровень pCO2 в последнем прижизненном анализе крови отрицательно коррелировал с абсолютным (на мм2) содержанием одиночных недегранулирующих триптаза-позитивных ТК (r=-0,573; p=0,041). Содержание HCO3- в анализе крови при поступлении коррелировало с содержанием одиночных недегранулирующих (%) (r=0,640; p=0,025) и одиночных триптаза-позитивных ТК с признаками дегрануляции (%) (r=-0,717; p=0,009). Наконец, обнаружена сильная корреляционная связь абсолютного содержания совместно прилежащих дегранулирующих химаза-позитивных ТК с уровнем лактата (последний прижизненный анализ) (r=0,736; p=0,006).

Известно, что дегрануляция ТК является ответной реакцией на гипоксию и ацидоз [10]. В то же время кислый pH внутри секреторных гранул играет важную роль в поддержании активности триптазы [11]. Описанные нами связи показателей ТК с уровнем pH говорят о зависимости дегрануляции ТК от кислотности среды и свидетельствуют об усилении этого процесса в условиях ацидоза.

Выводы. Таким образом, в исследуемой выборке пациентов, умерших от COVID-19, в сравнении с контролем установлено увеличенное представительство триптаза-позитивных ТК, их меньшая дегрануляционная активность и сниженное содержание химаза-позитивных ТК. Обнаружено уменьшение содержания одиночных, в том числе недегранулирующих, триптаза-позитивных ТК и рост доли их фрагментов как свидетельства дегрануляции при увеличении продолжительности проведения НИВЛ и появлении потребности в иИВЛ, что отражает динамику процесса дегрануляции ТК у пациентов с COVID-19. Выявлены связи, указывающие на усиление дегрануляции триптаза- и химаза-позитивных ТК в условиях респираторного ацидоза, сопровождающего явление дыхательной недостаточности у пациентов с COVID-19. Полученные данные открывают новые аспекты участия ТК в патогенезе COVID-19 и перспективы использования препаратов, влияющих на ТК и их протеазы для лечения COVID-19.

×

About the authors

Andrey Valerievich Budnevsky

Burdenko State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: budnev@list.ru

MD, Professor, Head of the Department of Faculty Therapy, Vice-rector for NID

Russian Federation, 10 Studentskaya str., Voronezh, 394036, Russia.

Evgeniy Sergeevich Ovsyannikov

Burdenko State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ovses@yandex.ru

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of Faculty Therapy

Russian Federation, 10 Studentskaya str., Voronezh, 394036, Russia.

Inessa Alekseevna Savushkina

Burdenko State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: savushkinainessa@yandex.ru

postgraduate student of the Faculty Therapy Department

Russian Federation, 10 Studentskaya str., Voronezh, 394036, Russia.

Victoria Viktorovna Shishkina

Burdenko State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: 4128069@gmail.ru

PhD, Associate Professor, Director of the EBM Research Institute

Russian Federation, 10 Studentskaya str., Voronezh, 394036, Russia.

Nadezhda Hennadievna Alekseeva

Burdenko State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: nadya.alekseva@mail.ru

postgraduate student of the Faculty Therapy Department

Russian Federation, 10 Studentskaya str., Voronezh, 394036, Russia.

Inna Mikhailovna Perveyeva

BOOZ VOCB No. 1

Email: perveeva.inna@yandex.ru

PhD, pulmonologist

Russian Federation, 151 Moskovsky Ave., Voronezh, 394066, Russia

Karina Valeryevna Vostrikova

Burdenko State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: prudnikova.2012@inbox.ru

Assistant of the Faculty Therapy Department

Russian Federation, 10 Studentskaya str., Voronezh, 394036, Russia.

References

  1. Kosanovic D, Luitel H, Dahal BK, Cornitescu T, Janssen W, Danser AH, et al. Chymase: a multifunctional player in pulmonary hypertension associated with lung fibrosis. Eur Respir J. 2015 Oct;46(4):1084-94. doi: 10.1183/09031936.00018215.
  2. Атякшин Д.А., Костин А.А., Клочкова С.В., Шишкина В.В., Никитюк Д.Б., Алексеева Н.Т. Биогенез и секреторные пути химазы тучных клеток: структурно-функциональные аспекты. Гены и Клетки. 2021; 16 (3): 33-43. doi: 10.23868/202110004.
  3. Madjene LC, Danelli L, Dahdah A, Vibhushan S, Bex-Coudrat J, Pacreau E, et al. Mast cell chymase protects against acute ischemic kidney injury by limiting neutrophil hyperactivation and recruitment. Kidney Int. 2020 Mar;97(3):516-527. doi: 10.1016/j.kint.2019.08.037.
  4. Атякшин Д.А., Бурцева А.С., Алексеева Н.Т. Триптаза как полифункциональный компонент секретома тучных клеток. Журнал анатомии и гистопатологии. 2017; 6(1):121-132. doi: 10.18499/2225-7357-2016-6-1-121-132.
  5. Tan J, Anderson DE, Rathore APS, O'Neill A, Mantri CK, Saron WAA, et al. Signatures of MCs activation are associated with severe COVID-19. medRxiv. 2021 Jun: 2021.05.31.21255594. doi: 10.1101/2021.05.31.21255594.
  6. Zhou Z, Ren L, Zhang L, Zhong J, Xiao Y, Jia Z, et al. Heightened Innate Immune Responses in the Respiratory Tract of COVID-19 Patients. Cell Host Microbe. 2020 Jun 10;27(6):883-890.e2. doi: 10.1016/j.chom.2020.04.017.
  7. Gebremeskel S, Schanin J, Coyle KM, Butuci M, Luu T, Brock EC, et al. Mast Cell and Eosinophil Activation Are Associated With COVID-19 and TLR-Mediated Viral Inflammation: Implications for an Anti-Siglec-8 Antibody. Front Immunol. 2021 Mar 10;12:650331. doi: 10.3389/fimmu.2021.650331.
  8. Motta Junior JDS, Miggiolaro AFRDS, Nagashima S, de Paula CBV, Baena CP, Scharfstein J, et al. Mast Cells in Alveolar Septa of COVID-19 Patients: A Pathogenic Pathway That May Link Interstitial Edema to Immunothrombosis. Front Immunol. 2020 Sep 18;11:574862. doi: 10.3389/fimmu.2020.574862.
  9. Будневский А.В., Авдеев С.Н., Овсянников Е.С., Шишкина В.В., Есауленко Д.И., Филин А.А., и др. Роль тучных клеток и их протеаз в поражении легких у пациентов с COVID-19. Пульмонология. 2023; 33 (1): 17–26. doi: 10.18093/0869-0189-2023-33-1-17-26
  10. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы цитотоксического действия гипоксии. Научное обозрение. Медицинские науки. 2017; 2: 60-63. URL: https://science-medicine.ru/ru/article/view?id=982 (дата обращения: 20.06.2024).
  11. Pejler G, Hu Frisk JM, Sjöström D, Paivandy A, Öhrvik H. Acidic pH is essential for maintaining mast cell secretory granule homeostasis. Cell Death Dis. 2017 May 11;8(5):e2785. doi: 10.1038/cddis.2017.206.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies