Study of the toxicity of the drug Rinoferon in immature rats

Full Text

Актуальность. Острые респираторные инфекции занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии у детей [1-3]. Высокая заболеваемость объясняется легкостью передачи инфекции, многообразием респираторных вирусов и их антигенной изменчивостью, наличием большого количества пневмотропных бактерий, а также возможностью длительной персистенции возбудителей на фоне возрастных особенностей иммунитета. Для всех острых респираторных инфекций характерны поражение слизистых оболочек дыхательных путей, снижение местной защиты и ослабление неспецифических факторов иммунитета [7-8]. Принимая во внимание, что система интерферона — важнейшее звено врожденного иммунитета, использование интерферона при лечении детей с острыми респираторными инфекциями является одним из наиболее перспективных направлений [4]. При этом в педиатрической практике особое место занимает генно-инженерный интерферон-α2b, безопасность и эффективность которого как при эндоназальном (в виде мази и геля) доказана в ряде исследований. [6]. Интерферон альфа блокирует размножение всех видов респираторных вирусов, к нему отсутствует эффект привыкания, поскольку вирусы практически неспособны приобрести устойчивость к его действию. Биологическое действие интерферона характеризуется универсальностью, высокой активностью против многих ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Кроме того, интерферон индуцирует выработку противовирусных антител. [7-8].  В настоящее время является актуальным изучение токсичности нового генно-инженерного интерферона-α2b препарата Риноферон в виде спрея. Целью работы является изучение токсических эффектов лекарственного препарата Риноферон, спрей назальный дозированный, 500 МЕ/доза (ОАО Фармстандарт-Лексредства, Россия) при многократном интраназальном введении в двух экспериментальных дозах самцам и самкам неполовозрелых крыс в течение 14 дней с последующим 14-дневным периодом отмены введения.

Материал и методы исследования. Исследование проведено на 72 неполовозрелых (ювенильных), беспородных белых лабораторных крысах, 36 самцов и 36 самок, масса которых в начале исследования составляла 35-60 г. Использованы животные прошедшие карантинный режим в течение одной недели. Содержание с соблюдением правил светового режима 12 часовой период освещения, температура
18-22◦С, влажность 50-65%, корм и вода -ad libitum, на стандартной диете лабораторных животных. Животные были получены из филиала «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН (Московская обл.). При выполнении исследования строго соблюдали положения «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для эксперимента или в иных научных целях» [Derective2014/63/EU]. Исследование обобрено локальным Этическим комитетом (протокол № 7-2023 от 11 сентября 2023г.). Объектами настоящего исследования являлись исследуемый препарат Риноферон, спрей назальный дозированный, 500 МЕ/доза (ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия). В качестве контроля использовали Носитель (Плацебо Риноферон). Для исследования 14-дневной токсичности при ежедневном интраназальном введении использовали два варианта дозировки препаратов: 1400 и 2800 МЕ/кг. Животные случайным образом были распределены на три группы (табл. 1).

Таблица 1 – Использованные препараты и распределение животных на группы исследования

№ группы	Тестируемый препарат	Выведение животных из эксперимента				Доза действующего вещества	Объем введения (мл/кг)
		на 15-й день		на 29-й день
		самцы	самки	самцы	самки
1	Плацебо	6	6	6	6	-	0,14 мл/кг*
2	Риноферон	6	6	6	6	1400 МЕ/кг	0,14 мл/кг
3		6	6	6	6	2800 МЕ/кг	0,14 мл/кг*

Примечание. * – дважды в течение дня с интервалом не менее 30 минут

 

Исследования проведены с использованием визуального, инструментального и лабораторного контроля за состоянием животных, современных методов оценки действия препаратов в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под общей редакцией д.м.н. А.Н. Миронова и правилами надлежащей лабораторной практики GLP [5].

При формировании групп и в процессе эксперимента проводили тщательный осмотр животных. В первый день введения и еженедельно в последующем, в течение часа после введения на 1-й, 7-й, 14-й, а также после отмены введения препаратов на 21-й, 28-й дни исследования, в первой половине дня. Фиксировали следующие признаки: поза/мышечный тонус; слюнотечение; реакция на взятие; пилоэрекция; экскреция-уринация/дефекация; вокализация; прикрытие глаз; дыхание; цвет кожи и слизистых; выделения вокруг глаз/носа; бдительность; подвижность.

Массу тела регистрировали при формировании групп непосредственно перед первым введением (1-й день), далее в период введения дважды в неделю (4-й, 7-й, 11-й, 14-й дни исследования). В период отмены введения препаратов также два раза в неделю (18-й, 21-й, 25-й, 28-й дни исследования). Масса тела животного, на тощак, непосредственно перед выведением из эксперимента на 15-й и 29-й дни исследования была взята для расчета процентного отношения массы органов к массе тела.

Потребление корма определяли количественно для клетки содержания еженедельно (6-7, 13-14, 20-21, 27-28 дни исследования) взвешиванием решетки с кормом в начале суток и спустя 24 часа.

Гематологический анализ проводили в день взятия проб крови на гематологическом анализаторе CELL-DYN 3700. Учету подлежали: количество эритроцитов (RBC); уровень гемоглобина (Hb); гематокрит (HCT); количество лейкоцитов (WBC); количество лимфоцитов (LYM, LYM%); количество моноцитов (MON, MON%); количество гранулоцитов (GRA, GRA%); среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH); средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC); средний объем эритроцита (MCV); широта распределения эритроцитов по объему – коэффициент вариации (RDW); широта распределения эритроцитов по объему – стандартное отклонение (RDW-SD); количество тромбоцитов (PLT); средний объем тромбоцитов (MРV); тромбокрит (PCT); широта распределения тромбоцитов по объему – коэффициент вариации (РDW).

Сыворотку крови исследовали с помощью автоматического биохимического анализатора AU640 с использованием соответствующих для каждого параметра наборов реагентов. Оценке подлежал уровень: аланинаминотрансфераза (ALT); аспартатаминотрансфераза (AST); щелочная фосфатаза (ALP); общий белок (TProt); альбумин (Alb); глобулин (G)*; альбумин/глобулин (A/G)*; глюкоза; креатинин (Crea); мoчевина (Urea); общий билирубин (TBil); холестерин (Chol); триглицериды (Trigs); Na⁺; K⁺; Cl^-   (* – расчётные значения).

После вскрытия у всех животных выполняли взвешивание головного мозга, сердца, легких, тимуса, селезенки, печени, почек, надпочечников, яичников/семенников.  Парные органы были взвешены вместе, кроме веса органов, определяли процентное отношение веса органа к весу тела. Гистологические исследования проводили у животных из группы плацебо и групп, получавших максимальную дозу тестируемого препарата и препарата сравнения на 15-й и 29-й день исследования.

Статистический анализ выполнялся с помощью пакета стандартных статистических программ. Различия считали значимыми при вероятности ошибки не более 5%.

Полученные результаты и их обсуждение. Общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними. Смертности животных по естественным причинами или в результате травм не было отмечено. Особенностей поведения у подопытных крысят, получавших интраназально исследуемый препарат Риноферон, отличных от животных, получавших плацебо, не отмечено [3, 4]. Интенсивность и характер двигательной активности не менялись в течение всех 28 дней наблюдения и не отличались от показателей контрольных животных. Судороги отсутствовали у всех животных, находившихся под наблюдением. Координация движений и тонус скелетных мышц у крысят в опытных группах в течение 28 дней эксперимента в пределах нормы, отличий от соответствующих показателей животных контрольной группы не выявлено. Реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители была адекватной у всех подопытных животных, отличий между животными опытных и контрольной группы не наблюдалось. Частота и глубина дыхательных движений у экспериментальных крысят визуально была неотличимой от животных из контрольной группы. Состояние волосяного и кожного покровов экспериментальных животных не отличалось от волосяного и кожного покровов контрольных животных. Нарушений функционирования органов чувств не было зарегистрировано ни у одного животного, находящегося под наблюдением в течение 28 дней.

Таблица 2 – Результаты влияния исследуемых препаратов на массу тела крысят (г)

Группа исследования	Статист. параметр	Дни наблюдения
		1-й (n=12)	4-й (n=12)	7-й (n=12)	11-й (n=12)	14-й (n=12)	18-й (n=6)	21-й (n=6)	25-й (n=6)	28-й (n=6)
Плацебо самцы	M	40,33	47,52	54,13	60,28	67,41	72,30	79,63	87,37	94,48
	SD	4,18	5,38	6,37	7,68	8,25	6,47	7,67	8,34	9,50
Плацебо самки	M	43,60	50,82	57,96	64,71	72,61	78,43	85,58	93,85	102,77
	SD	4,22	4,82	5,45	5,82	6,51	9,85	8,97	11,61	15,07
Риноферон 1400 МЕ/кг самцы	M	41,07	48,15	55,54	63,25	71,88	81,92	88,73	98,45	105,38
	SD	5,22	6,60	7,16	7,54	9,25	9,39	11,69	13,99	14,47
	p	0,71	0,80	0,62	0,35	0,22	0,07	0,14	0,13	0,15
Риноферон 1400 МЕ/кг самки	M	43,07	50,59	57,72	65,68	74,34	85,03	93,93	101,5	109,82
	SD	4,84	6,04	7,31	8,94	10,14	9,17	11,02	12,76	16,33
	p	0,78	0,92	0,93	0,76	0,62	0,26	0,18	0,30	0,46
Риноферон 2800 МЕ/кг самцы	M	42,24	49,85	57,18	64,54	71,99	77,32	85,75	95,57	104,83
	SD	4,91	5,99	7,13	7,78	9,20	9,95	11,40	11,72	14,06
	p	0,32	0,33	0,28	0,19	0,21	0,32	0,30	0,19	0,17
Риноферон 2800 МЕ/кг самки	M	40,79	47,48	53,18	60,02	67,27	71,53	79,18	86,48	92,75
	SD	4,56	5,83	6,16	7,37	8,86	11,34	12,61	12,01	14,19
	p	0,13	0,14	0,06	0,10	0,11	0,29	0,33	0,31	0,26

 

Во время 14-дневного введения исследуемых препаратов крысятам в изучаемых дозах, а также в течение последующих 14 дней после прекращения введения, видимые слизистые оболочки, как и у контрольных животных, оставались бледно-розового цвета, влажность их не изменялась, симптомы бронхита, конъюнктивита и ринита отсутствовали. Частота дефекации и мочеиспускания, консистенция фекальных масс и окраска мочи подопытных и контрольных животных не изменялись в результате интраназального введения изучаемого препарата в дозах 1400 и 2800 МЕ/кг.

Показатели массы тела крысят, наблюдавшиеся в течение 14 дней интраназального введения исследуемых препаратов в дозах 1400 и 2800 МЕ/кг, а также в течение 14 дней после отмены их введения, приведены в таблице 2.

К 14-му дню эксперимента в группах животных, получавших изучаемый препарат и препарат сравнения, статистически значимых отличий в показателях массы тела от группы контроля не наблюдалось. На протяжении всего периода наблюдения за животными была зарегистрирована положительная динамика набора массы тела, статистически значимого отставания в показателях массы тела крысят, получавших исследуемый препарат от группы контроля (плацебо) не наблюдалось.

Во всех группах наблюдалась схожая динамика потребления крысятами корма, при этом количество потребляемого животными корма соответствовало нормальным значениям показателей для животных данного вида и возраста. Значимых различий между опытными группами животных и группой контроля (плацебо) не наблюдалось.

Также отмечалось отсутствие изменения общего состояния, качественных и количественных показателей крови и функционального состояния внутренних органов экспериментальных крыс по сравнению с группой контрольных животных, получавших плацебо.

Результаты гематологических и биохимических исследований крови крысят на 15-е и 29-е сутки исследования у 12 животных из каждой группы (по 6 самцов и 6 самок) продемонстрировали отсутствие статистически значимых различий в исследуемых показателях между группами животных, получавших исследуемый препарат Риноферон в дозах 1400 и 2800 МЕ/кг, а также с контрольными животными из группы плацебо на обоих ключевых этапах исследования. Полученные данные свидетельствуют о том, что все тестируемые препараты в исследуемом диапазоне доз не оказывали негативного влияния на эритро-, лейко-, тромбопоэз, лейкоцитарную формулу и биохимические маркеры повреждения внутренних органов.

В ходе проведения некропсии визуально различимых изменений не было обнаружено ни у одного экспериментального животного. Патологических изменений волосяного покрова, кожи, легких, сердца, аорты, почек, надпочечников, матки, яичников, молочных желёз, семенников, простаты, щитовидной железы, паращитовидных желез, тимуса, лимфатических узлов, не выявлено. Брюшина влажная, гладкая, с естественным блеском, на ощупь скользкая. Спаечный процесс не обнаружен. Органы брюшной полости занимали типичное положение. Внутренние органы имели обычное расположение и макроскопическое строение. Видимых изменений видимые слизистые ротовой полости, стенки мочевого пузыря языка, не наблюдалось. Пищевод, желудок, тощая, ободочная кишка спавшаяся. Стенка ободочной кишки гладкая, эластическая, бледно-розового цвета, с естественным блеском, эластичная, с окружающими тканями не спаяна. Слизистая бледно-розового цвета с хорошо выраженными складками, изъязвления отсутствовали. Печень бледно-красно-коричневого цвета с естественным блеском, эластической консистенцией. Поверхность гладкая. Четко определялась долевая архитектура. Поджелудочная железа светло-розового цвета с естественным блеском, поверхность характерная для железистой структуры, эластической консистенции, гомогенная, без очаговых явлений, с окружающими тканями не спаяна. На разрезе ткань характерного вида для железистой ткани. Селезенка красного цвета, эластической консистенции. Поверхность мелко-бугристая, однородная. С окружающими тканями не спаяна. На разрезе паренхима однородная красного цвета, без очаговых изменений. Соскоб умеренный красного цвета.

При вскрытии грудной полости патологических изменений не обнаружено. Плевра не утолщена, прозрачна. На внутренней поверхности бледно-розового цвета, гладкая, имела естественный блеск. Спаечный процесс отсутствовал. Поверхность легких светло-розового цвета, с естественным блеском, гладкая. С окружающими тканями не спаяна. На разрезе ткань светло-розового цвета с визуализированными бронхами разного порядка. Очаговые явления отсутствовали. Соскоб розового цвета с пузырьками воздуха. Перикард полупрозрачный, бесцветный, не спаян с окружающими тканями. Внутренняя поверхность гладкая, с естественным блеском.

Головной мозг обычной формы. В обоих полушариях четко определяются извилины с кровеносными сосудами. Ткань головного мозга бледно-розового цвета, эластической консистенции. Очаговых явлений не обнаружено. Спинной мозг заполняет спинномозговой канал, имеет обычное строение, на разрезе имеет типичный вид «бабочки». Ликвор без патологических примесей. Периферические нервы без патологических изменений.

При применении плацебо масса органов составила: у самцов на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,351 г (0,509%), легкие - 0,473 г (0,694%), тимус - 0,185 г (0,272%), печень - 2,556 г (3,761%), селезенка - 0,215 г (0,318%), почки - 0,680 г (1,000%), надпочечники - 0,020 г (0,030%), головной мозг - 1,277 г (1,878%), семенники - 0,958 г (1,410%); у самок на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,368 г (0,511%), легкие - 0,514 г (0,694%), тимус - 0,198 г (0,268%), печень - 2,820 г (3,812%), селезенка - 0,233 г (0,314%), почки - 0,743 г (1,004%), надпочечники - 0,022 г (0,029%), головной мозг - 1,336 г (1,810%), яичники - 0,022 г (0,031%); у самцов на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,0,444 г (0,471%), легкие - 0,566 г (0,599%), тимус - 0,215 г (0,227%), печень – 3,617 г (3,827%), селезенка - 0,293 г (0,309%), почки - 0,868 г (0,917%), надпочечники - 0,024 г (0,026%), головной мозг - 1,374 г (1,451%), семенники - 1,508 г (1,592%); у самок на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,492 г (0,477%), легкие - 0,619 г (0,601%), тимус - 0,230 г (0,222%), печень – 3,919 г (3,801%), селезенка - 0,312 г (0,303%), почки – 0,943 г (0,915%), надпочечники - 0,027 г (0,026%), головной мозг - 1,493 г (1,450%), яичники - 0,040 г (0,039%).

В группе применения препарата Риноферон в дозе 1400 МЕ/кг достоверной разницы с группой плацебо не выявлено и составила у самцов на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,345 г (0,503%), легкие - 0,480 г (0,687%), тимус - 0,191 г (0,274%), печень - 2,633 г (3,771%), селезенка - 0,221 г (0,316%), почки - 0,708 г (1,015%), надпочечники - 0,021 г (0,031%), головной мозг - 1,275 г (1,829%), семенники - 0,965 г (1,384%); у самок на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,367 г (0,505%), легкие - 0,505 г (0,695%), тимус - 0,194 г (0,266%), печень - 2,790 г (3,835%), селезенка - 0,227 г (0,313%), почки - 0,731 г (1,006%), надпочечники - 0,021 г (0,029%), головной мозг - 1,336 г (1,835%), яичники - 0,022 г (0,031%); у самцов на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,505 г (0,477%), легкие - 0,646 г (0,610%), тимус - 0,236 г (0,224%), печень - 4,045 г (3,825%), селезенка - 0,319 г (0,303%), почки - 0,963г (0,910%), надпочечники - 0,027 г (0,026%), головной мозг - 1,540 г (1,455%), семенники - 1,738г (1,646%); у самок на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,516 г (0,469%), легкие - 0,657 г (0,598%), тимус - 0,248 г (0,226%), печень - 4,185 г (3,812%), селезенка - 0,333 г (0,304%), почки – 1,002 г (0,913%), надпочечники - 0,028 г (0,025%), головной мозг - 1,602 г (1,460%), яичники - 0,044 г (0,040%).

При применении препарата Риноферон в дозе 2800 МЕ/кг масса органов составила: сердце - 0,338 г (0,515%), легкие - 0,512 г (0,699%), тимус - 0,204 г (0,278%), печень - 2,782 г (3,797%), селезенка - 0,230 г (0,314%), почки - 0,735 г (1,004%), надпочечники - 0,023 г (0,031%), головной мозг - 1,375 г (1,878%), семенники - 0,978 г (1,334%); у самок на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,347 г (0,506%), легкие - 0,480 г (0,701%), тимус - 0,179 г (0,260%), печень - 2,623 г (3,830%), селезенка - 0,217 г (0,317%), почки - 0,676 г (0,986%), надпочечники - 0,021 г (0,031%), головной мозг - 1,273 г (1,855%), яичники - 0,021 г (0,030%); у самцов на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,487 г (0,468%), легкие - 0,619 г (0,595%), тимус - 0,232 г (0,224%), печень – 3,947 г (3,793%), селезенка - 0,308 г (0,296%), почки - 0,941 г (0,905%), надпочечники - 0,026 г (0,025%), головной мозг - 1,509 г (1,449%), семенники - 1,683 г (1,621%); у самок на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,441 г (0,476%), легкие - 0,568 г (0,614%), тимус - 0,207 г (0,224%), печень – 3,495 г (3,774%), селезенка - 0,282 г (0,304%), почки –

0,849 г (0,917%), надпочечники - 0,023 г (0,025%), головной мозг - 1,326 г (1,434%), яичники - 0,036 г (0,039%).

При макро- и микроскопическом исследовании внутренних органов и места введения препаратов не было обнаружено признаков токсических проявлений, вызванных введением исследуемых препаратов. Не наблюдалось патологических изменений у животных и в течение 14 дней после отмены введения препаратов. Дальнейшие гистологические исследования органов и тканей показали, что никаких видимых отличий в их строении у контрольных животных и крысят, получавших исследуемый препарат Риноферон в максимальной дозе 2800 МЕ/кг через 14 дней после начала введения и через 14 дней после отмены, не было.

Выводы. На основании проведенного исследования сделано заключение, что в протестированном диапазоне доз от 1400 до 2800 МЕ/кг исследуемый препарат Риноферон, спрей назальный дозированный, 500 МЕ/доза (ОАО Фармстандарт-Лексредства, Россия) по критериям токсичности в условиях многократного интраназального введения не было обнаружено признаков токсических проявлений, вызванных введением исследуемых препаратов у неполовозрелых самцов и самок крыс.

About the authors

Tatyana Viktorovna Anikanova

Belgorod State National Research University

Email: bocharnikova78@mail.ru

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Russian Federation, 85 Pobedy str., Belgorod, 308015

Tatyana Grigorievna Pokrovskaya

Belgorod State National Research University

Author for correspondence.
Email: pokrovskaia@bsu.edu.ru

MD, Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Russian Federation, 85 Pobedy str., Belgorod, 308015

Tatyana Nikolaevna Malorodova

Belgorod State National Research University

Email: malorodova_tn@mail.ru

PhD, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Russian Federation, 85 Pobedy str., Belgorod, 308015

References