Assessment of the fertilizing ability of sperm by the content of the tumor necrosis factor-alpha in seminal plasma

Full Text

Актуальность. В настоящее время в индустриально развитых странах отмечается снижение рождаемости, в том числе, за счет роста количества бесплодных браков. В структуре причин бесплодия нарушение мужской фертильности составляет более 40% [1]. Важное значение в определении роли «мужского фактора» имеет исследование эякулята [2].

В течение 30 и более лет широко проводится лечение супружеских пар с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [3]. Поскольку процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI) в России проводятся, в том числе, за счет средств обязательного медицинского страхования, неизбежно встает вопрос об эффективности расходования финансов. С этих позиций актуальной является необходимость поиска предикторов результативности программ ВРТ.

Выбор метода репродуктивной технологии у конкретной пары, прогноз наступления беременности, наличие или отсутствие патологии при развитии плода напрямую зависит от показателей здоровья женщины и качества спермы партнёра. Если в отношении участвующих в ЭКО/ ICSI женщин проводятся отдельные исследования по прогнозированию исходов данной процедуры [4-6], то в отношении мужчин – публикации практически отсутствуют, встречаются лишь единичные работы, посвященные данной проблеме [7]. Для того чтобы вероятность наступления беременности у партнерши была выше, при проведении ЭКО/ICSI важно использовать эякулят с более качественными характеристиками [7-9]. С этих позиций актуальным является раннее выявление мужской инфертильности у мужчин, сперма которых используется при реализации программ ВРТ.   

Отмечена взаимосвязь изменения содержания белков протеома семенной плазмы с показателями концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов [8-13]. Представляет интерес поиск индикаторных компонентов семенной плазмы, обладающих диагностической ценностью для выявления нарушений сперматогенеза [12]. Значимость оценки уровня того или иного белка протеома эякулята заключается в констатации факта его повышения или понижения, в том числе у мужчин с патологическими процессами в органах репродуктивной системы для оценки тяжести патологического состояния.

Одним из компонентов семенной плазмы, изменение концентрации которого косвенно может указывать на нарушение сперматогенеза, является фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α, англ. Tumor necrosis factor-alpha, TNFα) [14]. Указанный протеин относится к провоспалительным цитокинам, индуцирует синтез белков острой фазы воспаления (С-реактивный белок, интерлейкин-6 и другие), лихорадку, активацию мононуклеарных фагоцитов – формирует воспалительный ответ организма. Данный белок определяется как в крови [15], так и в других биологических жидкостях - ликворе [16], моче [17], сперме [14]. Выявлена также экспрессия ФНО-α в тканях яичка, придатка яичка и в самих сперматозоидах [18]. Нам представляется интересным рассмотреть показатель концентрации ФНО-α в качестве критерия фертильности эякулята, в том числе для определения результативности ВРТ.

Цель исследования – определить оплодотворяющую способность спермы у мужчин по концентрации ФНО-α в семенной плазме эякулята.

Материал и методы исследования. Выполнено одномоментное обсервационное исследование типа «случай-контроль». В работу были включены 95 мужчин репродуктивного возраста (32,7±6,3 года), проходивших обследование с целью уточнения причины бесплодного брака. Исследование выполнено с соблюдением этических принципов проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов, изложенных в Хельсинской декларации ВОЗ и было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России.

Сбору проб эякулята предшествовало 2–4 дневное половое воздержание, каждому мужчине была выполнена рутинная спермограмма [2]. Подсчет концентрации и общего числа сперматозоидов, оценки их подвижности вели с использованием анализатора спермы SQA–V («MES», Израиль). Объем эякулята определяли гравиметрически, рассчитывая разницу массы пустого контейнера и контейнера с материалом обследуемых. Для отделения семенной плазмы производили центрифугирование проб эякулята при 3000 об/мин.

Концентрацию ФНО-α определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест-системы «альфа- ФНО – ИФА – БЕСТ» (A-8756); АО «Вектор-Бест», Россия. Оптическую плотность проб регистрировали на вертикальном фотометре StatFax 3200 (Awareness Technology, США).

В зависимости от результатов спермограммы все мужчины были разделены на две группы. В основную группу (n = 61) были включены пациенты со сниженной плодовитостью спермы, характеризовавшейся уменьшением концентрации сперматозоидов и их общего содержания (олигоастенозооспермия различной степени тяжести) [воз6]. Мужчины основной группы были из супружеских пар, которые проходили лечение по поводу бесплодия с применением ЭКО.

Группу сравнения (n = 34) составили обследованными с нормальными показателями вязкости, концентрации сперматозоидов и общим содержанием сперматозоидов в эякуляте [2] (табл. 1).

Таблица 1 - Характеристика проб эякулята обследованных

Показатель		Основная группа (группа 1, n = 61)	Группа сравнения (группа 2, n = 34)	p* (U**)
Объем эякулята, мл	M ± SD	3,7 ± 2,0	3,3 ± 0,7	0,103 (826,500)
	Me [25% ; 75%]	3,6 [2, 9 ; 4, 7]	3,8 [2, 7 ; 3, 7]
	min-max	2,3-5,1	2,2-5,1
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	M ± SD	9,0 ± 2,64	87,3 ± 37,12	0,000 (0,00)
	Me [25% ; 75%]	9,2 [6, 9 ; 11, 3]	82,6 [57, 9 ; 110, 6]
	min-max	5,0-13,8	33,1-174,4
Количество сперматозоидов, млн/эякулят	M ± SD	33,6 ± 43,5	294,6 ± 142,8	0,000 (0,00)
	Me [25% ; 75%]	31,7 [22, 8 ; 40, 7]	293,2 [165, 7 ; 370, 4]
	min-max	13,0-64,3	78,1-679,3

Примечание: М - средняя арифметическая, SD - стандартное отклонение, Me – медиана, [25%; 75%] -интерквартильный размах, min (минимальное) и max (максимальное) значение.
*p – достоверность различий по критерию Манна – Уитни; **U - критерий Манна – Уитни.

 

Статистический анализ результатов исследований осуществлялся с использованием пакета статистических программ. Для каждого массива данных рассчитывали параметры описательной статистики: среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение (SD), медиану (Me) и интерквартильный диапазон (25% – 75%), а также минимальное (min) и максимальное (max) значение.

Проверка нормальности распределения количественных признаков была выполнена с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае, если сравниваемые переменные не могли быть приведены к нормальному распределению и имели статистически значимое различие групповых дисперсий, проверка гипотез о различии между выраженностью признака в сравниваемых переменных проводилась при помощи непараметрической статистики – использовали U-критерий Манна-Уитни для сравнения двух независимых выборок. Количественную оценку линейной связи между двумя случайными величинами определяли с использованием коэффициента ранговой корреляции (R) Спирмена. За максимально приемлемую вероятность ошибки первого рода (р) принимали величину уровня статистической значимости, равную или меньшую 0,05.

Нами были изучены возможности применения показателя концентрации ФНО-α в семенной плазме в качестве маркера нарушения плодовитости спермы путем выявления ценности положительного и отрицательного исходов ЭКО. Для этого рассчитывали диагностическую чувствительность (Se), диагностическую специфичность (Sp) и диагностическую эффективность (+VP) [19]. При уровне концентрации ФНО-α равном 9,5 пг/мл и выше (точка разделения) рассматривали возможный отрицательный результат ЭКО, в то же время при уровне данного показателя от 0 до 9,5 пг/мл семенную жидкость считали плодовитой и рассматривали возможный положительный результат ЭКО.

В случае беременности у партнерши после ЭКО и значении концентрации ФНО-α
в семенной плазме ниже 9,5 пг/мл до процедуры результат считали истинно положительным (a) [19], в случае также наступившей беременности и исследуемым показателем равном и выше 9,5 пг/мл результат считали ложно положительным (b). Если не был зарегистрирован факт беременности после ЭКО, но уровень ФНО-α в семенной плазме партнера до ЭКО был равен или выше значения точки разделения результат считали истинно отрицательным (d). И, соответственно, - у партнерши беременность наступила, но концентрация ФНО-α в семенной плазме была равна или выше 9,5 пг/мл результат рассматривали как ложно отрицательный (c). Диагностическую чувствительность рассчитывали по формуле Se = а/(а+с) [Мошкин2020]; диагностическую специфичность Sp = d/(в+d); диагностическую эффективность +VP = (а + d)/(а+в+с+d) и выражали в процентах [19].

Полученные результаты и их обсуждение. Среднее содержание ФНО-α в семенной плазме эякулята составило 11,17 ± 7,25 пг/мл, медиана и интерквартильный диапазон 9,18 [5, 61;14, 71] пг/мл, выявлен значительный разброс данных: от 2,48 до 33,98 пг/мл (рис. 1).

В основной группе концентрация ФНО-α в семенной плазме составила 14,52 ± 6,91, медиана и интерквартильный диапазон 12,45 [9, 18;17, 33] пг/мл, отмечался также значительный разброс данных: от 6,68 до 33,98 пг/мл. Группа сравнения характеризовалась меньшими аналогичными показателями – среднее значение 5,15 ± 2,17 пг/мл, медиана и интерквартильный диапазон 4,65 [3, 84;6, 23] пг/мл, данные варьировали от 2,48 до 12,76 пг/мл.

 

Рис. 1 – Концентрация фактора некроза опухоли-альфа (пг/мл) в семенной плазме обследованных

Сравнение уровня концентрации ФНО-α семенной плазмы между исследуемыми группами выявило статистически значимые различия (критерий Манна-Уитни U = 82,000; р< 0,00001), Отсутствует корреляция уровня содержания ФНО-α в семенной плазме с объемом спермы (коэффициент ранговой корреляции Спирмена R= 0,064604: в основной группе R1= -0,212450; в группе сравнения R2=0,317601), с концентрацией сперматозоидов (R= -0,617915: R1= 0,060406; R2= 0,130119), с числом сперматозоидов в эякуляте (R= -0,657871; R1= -0,108705; R2= 0,223394).

В супружеских парах, проходивших лечение бесплодия с применением ВРТ (мужчины основной группы), наибольшее число исходов ЭКО было представлено истинно положительными результатами (a) - 55,74% (табл. 2), остальные по численности были меньше и составили 22,95% истинно отрицательными результатами (d), 13,11% ложно отрицательными результатами (c) и 8,19% ложно положительными результатами (b).

Таблица 2 – Количество исходов экстракорпорального оплодотворения в соответствии со значением точки разделения

Вариант результата, диагностическая значимость	Количество исходов
Истинно положительные	34
Ложно положительные	5
Истинно отрицательные	14
Ложно отрицательные	8
Диагностическая чувствительность (%)	80,95
Диагностическая специфичность (%)	73,68
Диагностическая эффективность (%)	78,69

 

По нашему предположению, высказанному ранее [14] вероятной причиной снижения концентрации сперматозоидов у пациентов основной группы, наряду с другими причинами, может быть воспалительный процесс в органах мужской репродуктивной системы.

Известно, что использование эякулята партнера с более высокими показателями сперматогенеза повышает вероятность зачатия при ЭКО. Достаточно высокий процент показатели диагностической чувствительности, диагностической специфичности, диагностической эффективности подтверждают возможность использования концентрации ФНО-α в семенной плазме в качестве маркера нарушения фертильности эякулята (патент на изобретение №2785487) [20] и одного из критериев, по которому можно прогнозировать результат программ ВРТ.

Вышеописанные закономерности демонстрирует следующее клиническое наблюдение.

Пациент К., 29 лет. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке 6 лет. Частота половых сношений в паре более чем три раза в неделю, половая жизнь регулярная, контрацептивы не применялись. Беременность у партнёрши не наступала. Копулятивной дисфункции нет. Жена обследована гинекологом – патологии не выявлено. Из анамнеза жизни пациента: родился первым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Из перенесённых заболеваний – в детстве часто ОРВИ; эпидемический паротит, туберкулёз, заболевания, передающиеся половым путём, болезнь Боткина отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (всего сделано четыре в разное время) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед лечением пары: объем 4,5 мл, цвет серо-белый, консистенция - вязкая. Количество сперматозоидов в 1 мл 36 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте – 162 млн. Живых - 52%. Подвижные 35%, 63% - малоподвижные, 2% - неподвижные. Морфология: 85% - нормальные формы, 7% - патология головки, 5% - патология шейки, 3% - патология хвоста. Лейкоциты - нет, рН 7,4. Заключение по анализу спермы: Астенозооспермия. Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки. Определена концентрация фолликулостимулирующего гормона лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола в сыворотке крови. Результаты в норме. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринологических заболеваний не выявлено. Концентрация ФНО-α в эякуляте 11,8 пг/мл (перед процедурой ЭКО).

Диагноз: Бесплодие в браке.

По поводу лечения бесплодия семейной паре было рекомендовано применение ЭКО. После проведения данной процедуры беременность у партнёрши не наступила.

Пациент проходил терапию в течение более 1 года. Концентрация ФНО-α в эякуляте после лечения 9,1 пг/мл. Через 16 месяцев от начала обследования пары после проведения повторной процедуры ЭКО у партнёрши наступила беременность на фоне увеличения концентрации ФНО-α в сперме.

Данный пример иллюстрирует связь концентрации ФНО-α ниже 9,5 пг/мл в сперме с отсутствием воспалительного процесса в добавочных мужских половых железах и фертильностью эякулята.

Таким образом, вышеописанный способ обеспечивает точность прогнозирования плодовитости спермы (патент на изобретение №2785487), повышает достоверность выявления мужского фактора бесплодия на доклинических стадиях, позволяет в ранние сроки ставить на учёт таких пациентов (с повышенным уровнем ФНО-α в семенной плазме эякулята) и проводить им своевременную адекватную терапию с целью улучшения результатов лечения бесплодия в супружеской паре.

Выводы. Содержание фактора некроза опухоли-альфа в семенной плазме пациентов с олигоастенозооспермией статистически значимо выше в сравнении со здоровыми мужчинами. Концентрация фактора некроза опухоли-альфа в семенной плазме может использоваться как критерий отбора эякулята для использования при реализации программ ВРТ.

About the authors

Konstantin Galkovich

АНО ДПО «Пермский институт повышения квалификации работников здравоохранения»

Author for correspondence.
Email: kr20211@yandex.ru

к.м.н., доцент каф. внутренних болезней

Russian Federation, город Пермь, пр-кт Декабристов, д. 2

Dmitry Sosnin

д.м.н., профессор каф. факультетской терапии №2, профессиональной патологии и клинической лабораторной диагностики

Email: sosnin_dm@mail.ru

д.м.н., профессор каф. факультетской терапии №2, профессиональной патологии и клинической лабораторной диагностики

Russian Federation, г. Пермь, ул. Петропавловская, д. 26

References