The ratio of purine metabolites in type 1 and type 2 diabetes mellitus

Full Text

Актуальность. Сахарный диабет (СД) – эндокринное заболевание с множеством метаболических нарушений, которые могут привести к повреждению тканей и развитию макро- и микрососудистых осложнений [1]. В данном исследовании особое внимание уделяется пуриновому обмену, так как нуклеотиды играют важную роль в биохимических и внутриклеточных процессах, включая репликацию и транскрипцию ДНК, клеточное дыхание и апоптоз, углеводный обмен и синтез липидов [2].

Известно, что при патологических состояниях, включая сахарный диабет, во внеклеточное пространство выходят пуриновые метаболиты. Например, аденозин накапливается в биологических жидкостях в ответ на метаболический стресс, повреждение тканей и воспаление. Внутриклеточный биогенез аденозина заключается в последовательном дефосфорилировании молекул АТФ, АДФ и АМФ [3]. АТФ играет большую роль в углеводном обмене, она представляет собой источник энергии для транспорта, слияния инсулинсодержащих везикул с мембраной β-клетки и последующей секреции инсулина [4]. Соотношение пуриновых метаболитов используется для оценки тяжести тканевой ишемии и окислительного стресса [5]. Продукты метаболизма пуринов могут быть определены в составе различных жидкостей организма, включая слюну, и использованы для оценки изменений в обмене пуринов [6].

Целью данного исследования явилось определение соотношения пуриновых метаболитов (аденозин, аденозинмонофосфат, аденозиндифосфат, гуанозиндифосфат, аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат) в слюне здоровых и больных сахарным диабетом 1 (СД1) и 2 типа (СД2).

Материал и методы исследования. Объектом данного исследования была слюна практически здоровых людей и пациентов с сахарным диабетом 1 или 2 типа.

В контрольную группу вошли 40 практически здоровых доноров, включая 20 мужчин (41,05±3,54 года) и 20 женщин (43,35±3,18 года). Первую основную подгруппу составили 40 человек с сахарным диабетом 1 типа, среди них 20 мужчин (43,7±3,21 гг.) и 20 женщин (42,05±2,66 гг.). Длительность заболевания составляла 6,7±1,32 года у мужчин и 15,85±2,43 года у женщин. Вторая основную подгруппа представлена 40 больными с сахарным диабетом 2 типа: 20 мужчин (62,60±1,92 гг.) и 20 женщин (62,85±2,78 гг.). Средняя продолжительность заболевания у мужчин составила 14,7±1,75 года, у женщин - 12,1±1,39 года.

Диагнозы был поставлены в соответствии с критериями Комитета экспертов ВОЗ по сахарному диабету (1999).

Из сопутствующих заболеваний регистрировались диабетическая нейропатия (34,7% - СД1, 19,2% - СД2), диабетическая ретинопатия (28,3% - СД1, 13,4% - СД2), диабетическая нефропатия (20,5% - СД1, 7,2% – СД2), артериальная гипертензия (18,1% - СД1, 15,9% - СД2), хроническая сердечная недостаточность (12% - СД1, 10,8% - СД2).

В исследовании не участвовали больные сахарным диабетом с такими заболеваниями, как острый инфаркт миокарда, злокачественные новообразования, нарушение мозгового кровообращения, а также острые инфекционные заболевания и вирусные гепатиты.

Слюну собирали утром до приёма пищи после полоскания полости рта. В ходе сбора биологической жидкости доноры в течение 10 минут держали в ротовой полости стоматологический тампон, далее его помещали в слюносборник (Sarstedt D-51588 Numbrecht), центрифугировали 10 минут при 3000 g. Полученный центрифугат использовали в исследовании.

Полученные образцы слюны были проанализированы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на автоматизированной системе FPLS® System (Швеция). Для проведенного исследования применялась колонка размером 10 х 200 мм с Q Sepharose Fast Flow.

К отцентрифугированной слюне (600 мкл) дважды приливали по 200 мкл охлажденной хлорной кислоты. Полученный раствор тщательно перемешивали, а далее центрифугировали 5 минут. После осаждения нуклеопротеидного комплекса надосадочную жидкость (600 мкл) нейтрализовали 1 H раствором охлажденного гидроксида калия, далее центрифугировали 2-3 минуты

Полученный центрифугат (100 мкл) наносили на колонку. Перед внесением образца проводилось удаление неорганических солей из ионообменника сначала дистиллированной водой, а затем 1 Н раствором соляной кислоты. Уравновешивание системы производилось буферным раствором, состоящим из двух компонентов: А – 0,05 Н HCl; Б – 0,1 Н HCl + 0,5 М NaCl.

Время выхода буфера А составляло с 0 по 8 мин, буфера Б – с 9 по 31 мин.

Элюирование проходило со скоростью потока 1,5 мл/мин, регистрация при длине волны 260 нм.

Пуриновые метаболиты идентифицировали с помощью коммерческих препаратов нуклеозидов и нуклеотидов. Их содержание в слюне определялось путем измерения площади полученных пиков (%).

Для анализа полученных результатов использовалось программное обеспечение для статистического анализа STADIA 7.0 (InCo, Россия). Анализ количественных данных проводили при помощи параметрического критерия Стьюдента. Уровень значимости был установлен на уровне 5%.

Исследование было разрешено этическим комитетом ВГМУ им Н.Н. Бурденко, все испытуемые перед проведением клинического исследования подписали информированное согласие в соответствии с принципами Хельсинкской декларации ВМА (2013 г.) и Федерального закона «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» № 323-ФЗ от 21.11.2011 г.

Полученные результаты и их обсуждение. В ходе анализа полученных хроматограмм было установлено, что пуриновые метаболиты слюны условно здоровых людей и пациентов с сахарным диабетом элюируются в виде 6 фракций. Полученные пики пуринов отличались друг от друга. Общее количество всех высвобожденных пуринов в каждом образце слюны было принято за 100%, далее производился расчет каждой площади элюированных фракций (%).

Исследование пуриновых метаболитов в слюне выявило достоверные отклонения в содержании аденозина. Его содержание в слюне при СД1 и СД2 было повышено по сравнению с контрольной группой, гендерные отличия не наблюдались (рис. 1).

 

Рис. 1. Содержание аденозина в слюне в норме и при сахарном диабете 1 и 2 типа,
*- значимые отличия между практически здоровыми донорами
и пациентами с сахарным диабетом 1 и 2 типа (p≤0,05)

Многочисленные научные данные показывают важность аденозиновой системы в регуляции гомеостаза глюкозы путем модуляции секреции инсулина и чувствительности к инсулину в периферических метаболически активных тканях [9]. Сигнальные пути аденозина играют решающую роль в модуляции прогрессирования СД, в основном за счет вмешательства в функцию органов, регулирующих обмен веществ [5]. Также фосфорилирование аденозина до АМФ значительно нарушено в тканях органов при сахарном диабете из-за снижения активности аденозинкиназы, что приводит к увеличению концентрации аденозина в клетках. Внутриклеточное увеличение концентрации аденозина может привести к высвобождению его во внеклеточное пространство. Стоит отметить, что аденозин может предотвращать окислительный стресс путем индукции антиоксидантных систем (глутатионпероксидаза 1) в первичных эндотелиальных клетках человека, в свою очередь окислительный стресс может усиливать генерацию аденозина и передачу сигналов через аденозиновый рецептор [10].

Увеличение уровня АМФ, наряду со значительным увеличением содержания аденозина, позволяет предположить, что ускоренный повторный синтез мононуклеотидов является основной причиной увеличения пула мононуклеотидов у мужчин и женщин с СД1 и СД2 (таблица 1).

Таблица 1 - Содержание адениновых нуклеотидов в слюне в норме и при сахарном диабете 1 и 2 типа

Группы исследования		Показатели (% от общей площади)
		АМФ	АДФ	АТФ
Контрольная группа	1 подгруппа -мужчины, n=20	18,85±0,76*^	28,35±1,31*^	6,68±0,28*^+
	2 подгруппа - женщины, n=20	21,36±1,03*^	30,93±1,22*^	9,22±0,51*^+
Пациенты с СД 1	1подгруппа -мужчины, n=20	24,32±1,18*	23,15±1,18*	4,22±0,22*
	2 подгруппа - женщины, n=20	25,21±1,22*	22,07±1,08*	4,55±0,25*
Пациенты с СД 2	1подгруппа -мужчины, n=20	24,45±1,16^	23,35±1,22^	4,11±0,17^
	2 подгруппа - женщины, n=20	26,41±1,27^	21,14±1,18^	4,03±0,21^

Примечание: *- значимые отличия между здоровыми мужчинами и мужчинами СД1, между здоровыми женщинами и женщинами СД1 (p≤0,05); ^- значимые отличия между здоровыми мужчинами и мужчинами СД2, между здоровыми женщинами и женщинами СД2 (p≤0,05); +- значимые отличия между женщинами и мужчинами в группах (p≤0,05).

 

Также при СД1 и СД2 происходило уменьшение содержания АДФ и АТФ в сравнении с контрольной группой (таблица 1), притом достоверных отличий между мужчинами и женщинами не наблюдалось (p>0,05). Очевидно, что происходило нарушение энергетического обмена, что приводило к снижению уровня данных нуклеотидов, что можно использовать как дополнительный признак для оценки их функционального состояния при СД. Известно, что у больных сахарным диабетом вследствие нарушения липидного обмена наблюдаются функциональные и структурные изменения мембранных рецепторов клеток. Данный процесс сопровождается снижением активности мембраносвязанного фермента Na+, К+-АТРазы и инсулинсвязывающего рецептора. Происходит уменьшение чувствительности клеток к инсулину. По литературным данным известно, что данные реакции сопровождаются снижением уровня аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата при одновременном увеличении концентрации аденозинмонофосфата в крови [8]. Так как АМФ является компонентом пула аденилатов, то в физиологических условиях даже небольшие колебания в уровне АТФ приводят к изменению содержания АМФ.

В ходе исследования выявлено, что уровень гуанозиндифосфата и гуанозинтрифосфата при СД1 и СД2 были значительно ниже по сравнению с данными, полученными в контрольной группе (таблица 2).

Таблица 2 - Содержание гуаниновых нуклеотидов в слюне в норме и при сахарном диабете 1 и 2 типа

Группы исследования		Показатели (% от общей площади)
		ГДФ	ГТФ
Контрольная группа	1 подгруппа -мужчины, n=20	3,53±0,18*^	2,13±0,11*^
	2 подгруппа - женщины, n=20	3,80±0,18*^	1,91±0,10*^
Пациенты с СД 1	1подгруппа -мужчины, n=20	2,44±0,16*	1,42±0,08*
	2 подгруппа - женщины, n=20	2,51±0,15*	1,53±0,06*
Пациентыс СД 2	1подгруппа -мужчины, n=20	2,2±0,14^	1,39±0,07^
	2 подгруппа - женщины, n=20	2,13±0,09^	1,4±0,08^

Примечание: *- значимые отличия между здоровыми мужчинами и мужчинами СД1, между здоровыми женщинами и женщинами СД1 (p≤0,05); ^- значимые отличия между здоровыми мужчинами и мужчинами СД2, между здоровыми женщинами и женщинами СД2 (p≤0,05); +- значимые отличия между женщинами и мужчинами в группах (p≤0,05)

 

Известно, что избыток АФК вызывает повреждение ДНК и пула клеточных нуклеотидов, приводя к разрывам нитей ДНК, а также к образованию специфических окисленных оснований в ДНК. Снижение уровня ГТФ могло быть связано с его окислением, которое происходит при чрезмерном образовании свободных радикалов, а именно гидроксильного радикала [10]. Известно, что АТФ стимулирует синтез гуаниновых мононуклеотидов, а ГТФ – синтез адениновых мононуклеотидов, то есть происходит взаимоподдержание и взаимоусиление двух подсистем метаболизма пуринов [4].

Выводы. Развитие гипергликемии при сахарном диабете 1 и 2 типа сопровождается нарушением пуринового обмена. В ходе исследования установлены достоверные отклонения содержания пуриновых метаболитов в слюне больных СД1 и СД2 в сравнении с условно здоровыми мужчинами и женщинами. Наблюдается снижение уровня АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ при одновременном увеличении концентрации А и АМФ, что говорит о развитии тканевой ишемии и окислительного стресса.

About the authors

Anna Cheprasova

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Author for correspondence.
Email: cheprasova_81@mail.ru

ассистент каф. биологии

Russian Federation, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Sergei Popov

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Email: popov-endo@mail.ru

д.м.н., доцент, зав. каф.организации фармацевтического дела, клинической фармации и фармакогнозии

Russian Federation, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Alexander Pashkov

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Email: vgma-pashkov@yandex.ru

д.б.н., профессор каф. биологии

Russian Federation, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Olga Myachina

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Email: biolog@vrngmu.ru

д.м.н., доцент, зав. каф. биологии

Russian Federation, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.